① 亚硫酸氢盐测序法和焦磷酸测序的区别
基甲基化检测主要几种：
甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCRMSP)
用亚硫酸氢盐处理基组DNA所未发甲基化胞嘧啶转化尿嘧啶甲基化胞嘧啶变；随碧羡设计针甲基化非甲基化序列引物进行PCR通电泳检测MSP扩增产物用针处理甲基化DNA链引物能扩增片段则说大改明该滚慧判位点存甲基化；反说明检测位点存甲基化
2、亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCRBSP)
用亚硫酸氢盐处理基组DNA则未发甲基化胞嘧啶转化尿嘧啶甲基化胞嘧啶变随设计BSP引物进行PCR扩增程尿嘧啶全部转化胸腺嘧啶PCR产物进行测序判断CpG位点否发甲基化称BSP-直接测序PCR产物克隆至载体进行测序提高测序功率种称BSP-克隆测序
3、甲基化敏扩增态性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP利用DNA甲基化敏两种同裂酶Hpa IIMsp I基组DNA进行酶切连接由于两种酶能够识别相同限制性酶切位点即CCGG位点DNA序列CCGG位点现同程度甲基化状态别两种酶识别产物式体现
4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)
通准确定量单连续CpG 位点甲基化频率焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平细微改变序列延伸程根据CT掺入量定量确定单位点C-T比例同位点甲基化变异能准确检测由于焦磷酸测序提供真实序列数据甲基化状态序列形式呈现
② 【现学现卖】实验-DNA测序（第一代至第三代）
测序，简单来说就是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号。
一代测序
首先讲一下测序的基础方法，Sanger测序 (Sanger et al.,1977)
1977年Frederick Sanger和同事发展出双脱氧测序法（dideoxy sequencing method）或称链终止法，并对噬菌体phiX-174测序以来，测序原理并未有太多变化。后来测序方法的改革也几乎都是在此基础上，缩短时间，降低人力，比如①在每一种ddNTP中掺入不同的荧光标记，使测序在单一反应中就能进行。②使用极薄极长的充胶玻璃毛细管代替大的聚丙烯酰胺凝胶块，新的介质缺缓散散热更快，使电泳能在高压下进行，降低分离时间等诸如此类的减少分离时间的变革。③更换探查单一核苷酸的方法，用微转换器控制通过的电流检测核苷酸等等。
Sanger法测序需要引物，DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），有限量的双脱氧核苷三哪胡磷酸（ddNTPs）。按照碱基配对原则，dNTPs在引物之后按照模板延伸，ddNTPs的随机加入会由于它缺乏连接下一个的3’羟基而导致反应终止，由于ddNTPs的结合位置随机，我们会得到一系列大小不同的片段，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或同位素标记进行检测。也正是这个原理，所以测序得到较长的序列的概率低，长序列往往需要双向测序再进行拼接。
Maxam gilbert 化学法测序 (Maxam and Gilbert,1977)
几乎同时，Maxam和Gilbert发明了化学链降解法测序。
通过化学终止反应测序。首先双链变单链，准备工作完成。采用特定的化学试剂来从DNA链上断裂特定碱基，在5’端磷酸化（32P），四种化学反应：G反应，A+G反应，T+C反应，C反应，分别进行并产生一系列片段。然后进行电泳（electrophoresis），放射自显影（radioautography），最后可以整理得到序列。
二代测序（目前拥有这些测序仪的公司主要有Illumina，Thermo Fisher Scientific（已收购life，ABI， Ion torrent公司，所以在TFS官网可以找到这些测序仪），Roche）
一些和前后都没有紧密联系的概念
深度测序（deep sequencing）不是什么测序方法，而是根据对目的基因测序的depth和coverage（C）对测序方法的归类。如果这个片段被测序了大于7次（伏氏coverage>7），那么基本可以说是深度测序，大于100×称为ultra deep sequencing。还有一些概念比如length of genome（G）指全基因组长度，number of reads（N）片段数量，average read length（L）。
C=N×（L/G）
pyrosequencing 焦磷酸测序法 (Ronaghi, 2001) -454 二代测序 (Jarvie, 2005)
焦磷酸测序法
它后来发展称为Roche公司454技术所使用的测序方法。
是一种酶联级联测序技术，准确度可与Sanger媲美，且速度大大提高。具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量，低成本，快速地进行单核苷酸多态性（single nucle-otide potymorphisms, SNPs）研究提供了理想的技术支持。改进后的焦磷酸测序技术可以满足上百个核苷酸测序。但是测序长度一般在100bp左右，一直用于短序列分析。它的技术原理是4种酶在同一反应体系种级联化学发光反应，引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase），荧光素酶（luciferase）和磷酸酶（Apyrase）协同作用下，检测荧光，实时测定DNA序列。
454测序-固定的焦磷酸测序体系（2016年被Roche公司淘汰）
首先是序列处理：全基因组DNA处理为小的片段（鸟枪法处理的），在一端连接两端分别连接A和B（可以在PCR中产生大量的目的序列），然后解链变成带有adaptors的单链DNA，这个adaptorA的序列可以与小珠子上面的短序列B匹配，这样我们要测序的片段就被固定了。小珠子是不可溶的且与酶不反应的分子，作为固定表面。然后进行乳化PCR，得到了满载分子的小珠子并将它们放入小孔。接下来是焦磷酸测序的原理，引物是adaptorA，每次反应加一种dNTP，如果可以碱基配对，会在DNA聚合酶下结合在引物末端，释放一个分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，PPi与APS结合形成ATP，ATP与荧光素在荧光素酶作用下形成氧化荧光素，产生可见光。反应后冲洗掉剩余dNTP和少量ATP。
大多数现代测序方法都是分为这几步，主旨是实现高通量和自动化。①全基因组片段化。②adapter ligation末端连接短序列。③目标DNA与分子小珠子的结合。④将小珠子加载到孔板。⑤采用适合的方法测序。⑥数据处理。
连接酶法测序（Sequencing by ligation） (Albrecht et al.,2000) -ABI 公司SOLID测序 (Hedges et al.,2011)
连接酶测序法
利用的是DNA ligase的一个特性。连接酶是将DNA分子末端连接在一起的酶，它对DNA结构敏感，如果两条链的碱基不匹配，那么酶的效率很低。
具体如下图，模板链连接P1Adaptor，引入引物Pn与探针寡核苷酸混合物，一般8-9bp，前两个是与模板结合的碱基，中间三个为universal配对，后三个也是且5’连接荧光标记。在酶的作用下，正确配对的探针偏向与模板结合，然后荧光信号被检测并切除，露出5’端，继续反应。中间NNN的碱基部分可以通过加入引物Pn-1的方法，进行错位测序，之后整合数据。
ABI公司SOLID测序平台
在前期准备上与454测序相似，也会用到小分子的beads。但是测序方法为连接酶法，不是焦磷酸。
鸟枪法（shotgun sequencing） (Sutton et al.,1995) 测序- Ion torrent 公司PGM测序 (Merriman et al.,2012)
鸟枪法
传统的sanger法适合短一些的序列，当处理比如人类基因组的长序列时，需要鸟枪法将长序列变成短序列。并不是一个独特的测序方法，应该算是前处理技术。这些通过鸟枪法处理得到的短序列位点和长度随机，称为contigs（重叠群/连接片段）。然后用不同的测序方法测序，将结果输入电脑，它用算法（algorithm）将contigs的重叠部分进行拼接，得到完整序列。
Ion Torrent公司Proton测序仪
此方法比较快速。测序的原理与其他的不同，检测的不是荧光信号，而是核苷酸结合时释放的氢离子H+。同样全基因组→片段化，单链→连接adaptor→adaptors配对连接beads小分子→乳化PCR amplify。这些步骤与其他二代测序一样，不同的是Ion Torrent采用半导体芯片代替之前的孔板，加载携带序列的小分子在芯片上，芯片由可以承载小分子beads的孔和感受pH的传感器构成，这样前期准备就完成了。测序也是逐个加入四种核苷酸，检测产生的氢原子对溶液pH的影响，收集处理信号。
illumina 公司测序平台目前占据大部分市场，以HiSeq系列为主 (Quail et al., 2008)
特点是很便宜，速度也很快。①前期对基因组的片段化以及两端连接adaptorA,B与其他二代测序技术类似，②不同的是它没有用beads，核心反应容器是可以吸附流动DNA片段的测序流动槽（flowcell），每个flowcell上有8个道（lane），lane上面有与adaptorA,B相互配对的序列，所以可以固定DNA。③桥式PCR扩增与变性。先因为adaptorA,B序列而结合，形成拱桥性状，开始扩增，完成后双链和两端会再变性分开，新产生的单链作为模板再开始桥式反应。最后的结果是会产生一簇正反向的目的片段（详见下图）。④测序，检测荧光信号，整合结果。
第三代测序
PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies纳米孔单分子测序技术被称为第三代测序技术。其特点是不需要进行扩增，就是说小分子beads/桥式PCR的步骤是不需要的，而且产生的reads（读长）较长（>20kb）。
PacBio 公司的SMRT (Rhoads and Au,2015)
这个方法有点在上面提了，且速度快，由于是实时检测，所以还可以检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。但是缺点是错误率太高，以缺失序列和错位居多。SMRT芯片为测序载体（如同flowcell），不同碱基用不同荧光标记，在合成配对时检测荧光信号。
实现实时长序列测序的关键第一是采用的DNA聚合酶的活性保持，第二是区分配对的反应信号与周围游离碱基的强大背景荧光，采用零模波导孔原理，在反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多圆形纳米小孔达到降噪检测的目的。
Oxford Nanopore 的MinION (Mikheyev and Tin,2014)
是基于电信号的测序。它的特点是仪器真的非常小，reads更加长（几十甚至上百kb），而且DNA在测序中不被破坏，但是错误率同样很高。它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理，这是因为存在表观修饰的碱基激发的电流强度是不同的。这对于在基因组水平直接研究表观遗传等相关现象有极大的帮助。
技术核心是特殊的纳米孔，孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。
参考文献
Albrecht, G., Brenner, S., Dubridge, R.B., Lloyd, D.H., and Pallas, M.C. (2000) Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors. In: Google Patents.
Hedges, D.J., Guettouche, T., Yang, S., Bademci, G., Diaz, A., Andersen, A. et al. (2011) Comparison of three targeted enrichment strategies on the SOLiD sequencing platform. PloS one 6 .
Jarvie, T. (2005) Next generation sequencing technologies. Drug Discovery Today: Technologies 2 : 255-260.
Maxam, A.M., and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 74 : 560-564.
Merriman, B., D Team, I.T., and Rothberg, J.M. (2012) Progress in ion torrent semiconctor chip based sequencing. Electrophoresis 33 : 3397-3417.
Mikheyev, A.S., and Tin, M.M. (2014) A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer. Molecular ecology resources 14 : 1097-1102.
Quail, M.A., Kozarewa, I., Smith, F., Scally, A., Stephens, P.J., Durbin, R. et al. (2008) A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods 5 : 1005.
Rhoads, A., and Au, K.F. (2015) PacBio sequencing and its applications. Genomics, proteomics & bioinformatics 13 : 278-289.
Ronaghi, M. (2001) Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome research 11 : 3-11.
Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the national academy of sciences 74 : 5463-5467.
Sutton, G.G., White, O., Adams, M.D., and Kerlavage, A.R. (1995) TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects. Genome Science and Technology 1 : 9-19.
③ 焦磷酸测序一个样品多少钱
焦尘碧磷酸测序现在都是自动化了，价桥渣格每个地区可能会不一样，广州这边的市场大概是25元一个反应（一个反应大敏兄悄概有800bp数据量）
④ 焦磷酸测序的介绍
焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷弯银返酸测序搏乱法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序埋饥法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otidepotymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
⑤ [甲基化问题锦集]
今天和大家聊聊甲基化。
问：什么是表观遗传修饰？
答：基因组表观遗传修饰主要包括DNA甲基化修饰与核小体中组蛋白的修饰等，使得被修饰DNA的空间结构发生改变或使染色体结构发生改变，导致基因的沉默或过度表达。这两种修饰都是在不改变DNA碱基种类与数量的前提下使生物体表型呈现出多样化。
问：什么是DNA甲基化？
答：DNA甲基化是指在DNA 甲基化转移酶的作用下，将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5’-甲基胞嘧啶的过程。
问：DNA甲基化修饰有什么作用？
答：DNA甲基化是最早发现的一种表观遗传修饰，可能存在于所有高等生物中， 它并乎游不改变基因的碱基序列， 而是通过改变基因的表达影响细胞的功能，与基因沉默、X染色体失活、基因组印记、RNA i以及肿瘤等生物事件密切相关，它们的共同作用机制是调节基因的表达。
问：不同生物，DNA甲基化类型是一样的吗？
答：当然不一样啦。原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列，而真核生物中DNA甲基化一般只发生在CpG位点上，哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。
问：什么是CpG岛？
答：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段CpG序列密度很高，可达到均值5倍以上即所谓的CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。CpG岛的GC含量大于50%，经梁颂常出现在真核生物的编码基因的调控区。
问：CpG岛为什么要有个"p"，而不叫CG岛？p有什么特殊含意？
答：CpG是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤的缩写，p代表磷酸。
问：如何预测CpG岛？
答：由于CpG 岛区域较小，研究起来更为方便，因此，众多的研究热点集中在CpG 岛甲基化状态的研究上。而研究CpG岛甲基化的前提条件是确认最合适的CpG 岛区域。
目前有一些网站可以进行CpG岛的预测，我推荐几个比较好用的：
CpG Island（ http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx ） http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=TPM1+HOMO
http://www.urogene.org/methprimer/
CpGfinder( http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoter )
CpG islands revealing( http://l25.itba.mi.cnr.it/cgi-bin/wwwcpg.pl )
CpGPlot/CpGReport/Isochore( http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html )
然后用实验证实，可以用bisulfite sequencing来比较处理前后的不同，找到甲基化位点。
问：验证特定甲基化位点，并进行甲基化程度分析有哪些方法？
答：采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。
(1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；
(2) BSP克隆测橡顷郑序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并精确计算出甲基化程度百分比；
(3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围。
(4) 焦磷酸测序：测序有效长度不超过60bp，精确定量每一个CpG位点。
(5) MassARRAY® 平台：用于单个基因启动子区域的甲基化检测；每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG位点； 精准定量每一个CpG位点。
问：刚刚开始研究甲基化，如何寻找甲基化位点？
答：甲基化的研究是近年来较为火热的研究领域之一，您是不是也对它垂涎已久，却苦于无从下手？其实甲基化的研究并没那么难，一句话，还是套路！
首先，甲基化位点的筛选，可以使用全基因组Bisulfite测序（WGBS）、简化基因组甲基化测序（MethylRAD技术）或者甲基化芯片进行基因组整体水平甲基化检测，每种方法各有利弊，要根据实际的研究方向选择不同的方法。对于样品间差异甲基化位点的筛选，可以采用WGBS和MethylRAD技术，其中MethylRAD技术可以应用于无参考基因组的物种，Illumina Methylation EPIC芯片只能用于人类的DNA甲基化水平检测。当然也可以根据一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，预测该基因是否存在CpG岛；或者根据文献寻找相关基因的甲基化位点。
其次，对选择的特异位点进行甲基化验证，并进行甲基化程度分析。
最后，根据对照组和实验组样本的检测结果，分析甲基化位点与研究的相关性。
问：只知道基因名称，如何做甲基化检测？
答：只需要将物种及基因信息告知相应或测序公司，会为您提供全方位的检测服务。
原文： 甲基化问题锦集
⑥ 定时定量焦磷酸测序仪测一个样多长时间
15分钟内平行分析1-24个样本。。实时定量焦磷酸测序仪是一种用于基础医学领域的医学科研仪器，于2015年12月7日启用。技术指标SNP检测，DNA甲基化检测，等位基因检测。可靠的定量分析等升胡备位基因和甲基吵毁化做汪状态，15分钟内平行分析1-24个样本。
⑦ 焦磷酸测序技术为什么能正确测定DNA的序列
Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：
第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。
第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
第2步图示(图片来自互联网)
第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获没厅得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
第3步图示(图片来自互联网)
第4步：反猛链应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。
第4步图示(图片来自互联网)
第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
第4步图示(图片来自互联网)
Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率枝察孙测定、细菌和病毒分型等领域。