① 亞硫酸氫鹽測序法和焦磷酸測序的區別
基甲基化檢測主要幾種：
甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCRMSP)
用亞硫酸氫鹽處理基組DNA所未發甲基化胞嘧啶轉化尿嘧啶甲基化胞嘧啶變；隨碧羨設計針甲基化非甲基化序列引物進行PCR通電泳檢測MSP擴增產物用針處理甲基化DNA鏈引物能擴增片段則說大改明該滾慧判位點存甲基化；反說明檢測位點存甲基化
2、亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing PCRBSP)
用亞硫酸氫鹽處理基組DNA則未發甲基化胞嘧啶轉化尿嘧啶甲基化胞嘧啶變隨設計BSP引物進行PCR擴增程尿嘧啶全部轉化胸腺嘧啶PCR產物進行測序判斷CpG位點否發甲基化稱BSP-直接測序PCR產物克隆至載體進行測序提高測序功率種稱BSP-克隆測序
3、甲基化敏擴增態性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP利用DNA甲基化敏兩種同裂酶Hpa IIMsp I基組DNA進行酶切連接由於兩種酶能夠識別相同限制性酶切位點即CCGG位點DNA序列CCGG位點現同程度甲基化狀態別兩種酶識別產物式體現
4、焦磷酸測序(Pyrosequencing)
通准確定量單連續CpG 位點甲基化頻率焦磷酸測序能檢測並定量甲基化水平細微改變序列延伸程根據CT摻入量定量確定單位點C-T比例同位點甲基化變異能准確檢測由於焦磷酸測序提供真實序列數據甲基化狀態序列形式呈現
② 【現學現賣】實驗-DNA測序（第一代至第三代）
測序，簡單來說就是將DNA化學信號轉變為計算機可處理的數字信號。
一代測序
首先講一下測序的基礎方法，Sanger測序 (Sanger et al.,1977)
1977年Frederick Sanger和同事發展出雙脫氧測序法（dideoxy sequencing method）或稱鏈終止法，並對噬菌體phiX-174測序以來，測序原理並未有太多變化。後來測序方法的改革也幾乎都是在此基礎上，縮短時間，降低人力，比如①在每一種ddNTP中摻入不同的熒游標記，使測序在單一反應中就能進行。②使用極薄極長的充膠玻璃毛細管代替大的聚丙烯醯胺凝膠塊，新的介質缺緩散散熱更快，使電泳能在高壓下進行，降低分離時間等諸如此類的減少分離時間的變革。③更換探查單一核苷酸的方法，用微轉換器控制通過的電流檢測核苷酸等等。
Sanger法測序需要引物，DNA聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），有限量的雙脫氧核苷三哪胡磷酸（ddNTPs）。按照鹼基配對原則，dNTPs在引物之後按照模板延伸，ddNTPs的隨機加入會由於它缺乏連接下一個的3』羥基而導致反應終止，由於ddNTPs的結合位置隨機，我們會得到一系列大小不同的片段，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或同位素標記進行檢測。也正是這個原理，所以測序得到較長的序列的概率低，長序列往往需要雙向測序再進行拼接。
Maxam gilbert 化學法測序 (Maxam and Gilbert,1977)
幾乎同時，Maxam和Gilbert發明了化學鏈降解法測序。
通過化學終止反應測序。首先雙鏈變單鏈，准備工作完成。採用特定的化學試劑來從DNA鏈上斷裂特定鹼基，在5』端磷酸化（32P），四種化學反應：G反應，A+G反應，T+C反應，C反應，分別進行並產生一系列片段。然後進行電泳（electrophoresis），放射自顯影（radioautography），最後可以整理得到序列。
二代測序（目前擁有這些測序儀的公司主要有Illumina，Thermo Fisher Scientific（已收購life，ABI， Ion torrent公司，所以在TFS官網可以找到這些測序儀），Roche）
一些和前後都沒有緊密聯系的概念
深度測序（deep sequencing）不是什麼測序方法，而是根據對目的基因測序的depth和coverage（C）對測序方法的歸類。如果這個片段被測序了大於7次（伏氏coverage>7），那麼基本可以說是深度測序，大於100×稱為ultra deep sequencing。還有一些概念比如length of genome（G）指全基因組長度，number of reads（N）片段數量，average read length（L）。
C=N×（L/G）
pyrosequencing 焦磷酸測序法 (Ronaghi, 2001) -454 二代測序 (Jarvie, 2005)
焦磷酸測序法
它後來發展稱為Roche公司454技術所使用的測序方法。
是一種酶聯級聯測序技術，准確度可與Sanger媲美，且速度大大提高。具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為大通量，低成本，快速地進行單核苷酸多態性（single nucle-otide potymorphisms, SNPs）研究提供了理想的技術支持。改進後的焦磷酸測序技術可以滿足上百個核苷酸測序。但是測序長度一般在100bp左右，一直用於短序列分析。它的技術原理是4種酶在同一反應體系種級聯化學發光反應，引物與模板DNA退火後，在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase），熒光素酶（luciferase）和磷酸酶（Apyrase）協同作用下，檢測熒光，實時測定DNA序列。
454測序-固定的焦磷酸測序體系（2016年被Roche公司淘汰）
首先是序列處理：全基因組DNA處理為小的片段（鳥槍法處理的），在一端連接兩端分別連接A和B（可以在PCR中產生大量的目的序列），然後解鏈變成帶有adaptors的單鏈DNA，這個adaptorA的序列可以與小珠子上面的短序列B匹配，這樣我們要測序的片段就被固定了。小珠子是不可溶的且與酶不反應的分子，作為固定表面。然後進行乳化PCR，得到了滿載分子的小珠子並將它們放入小孔。接下來是焦磷酸測序的原理，引物是adaptorA，每次反應加一種dNTP，如果可以鹼基配對，會在DNA聚合酶下結合在引物末端，釋放一個分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，PPi與APS結合形成ATP，ATP與熒光素在熒光素酶作用下形成氧化熒光素，產生可見光。反應後沖洗掉剩餘dNTP和少量ATP。
大多數現代測序方法都是分為這幾步，主旨是實現高通量和自動化。①全基因組片段化。②adapter ligation末端連接短序列。③目標DNA與分子小珠子的結合。④將小珠子載入到孔板。⑤採用適合的方法測序。⑥數據處理。
連接酶法測序（Sequencing by ligation） (Albrecht et al.,2000) -ABI 公司SOLID測序 (Hedges et al.,2011)
連接酶測序法
利用的是DNA ligase的一個特性。連接酶是將DNA分子末端連接在一起的酶，它對DNA結構敏感，如果兩條鏈的鹼基不匹配，那麼酶的效率很低。
具體如下圖，模板鏈連接P1Adaptor，引入引物Pn與探針寡核苷酸混合物，一般8-9bp，前兩個是與模板結合的鹼基，中間三個為universal配對，後三個也是且5』連接熒游標記。在酶的作用下，正確配對的探針偏向與模板結合，然後熒光信號被檢測並切除，露出5』端，繼續反應。中間NNN的鹼基部分可以通過加入引物Pn-1的方法，進行錯位測序，之後整合數據。
ABI公司SOLID測序平台
在前期准備上與454測序相似，也會用到小分子的beads。但是測序方法為連接酶法，不是焦磷酸。
鳥槍法（shotgun sequencing） (Sutton et al.,1995) 測序- Ion torrent 公司PGM測序 (Merriman et al.,2012)
鳥槍法
傳統的sanger法適合短一些的序列，當處理比如人類基因組的長序列時，需要鳥槍法將長序列變成短序列。並不是一個獨特的測序方法，應該算是前處理技術。這些通過鳥槍法處理得到的短序列位點和長度隨機，稱為contigs（重疊群/連接片段）。然後用不同的測序方法測序，將結果輸入電腦，它用演算法（algorithm）將contigs的重疊部分進行拼接，得到完整序列。
Ion Torrent公司Proton測序儀
此方法比較快速。測序的原理與其他的不同，檢測的不是熒光信號，而是核苷酸結合時釋放的氫離子H+。同樣全基因組→片段化，單鏈→連接adaptor→adaptors配對連接beads小分子→乳化PCR amplify。這些步驟與其他二代測序一樣，不同的是Ion Torrent採用半導體晶元代替之前的孔板，載入攜帶序列的小分子在晶元上，晶元由可以承載小分子beads的孔和感受pH的感測器構成，這樣前期准備就完成了。測序也是逐個加入四種核苷酸，檢測產生的氫原子對溶液pH的影響，收集處理信號。
illumina 公司測序平台目前占據大部分市場，以HiSeq系列為主 (Quail et al., 2008)
特點是很便宜，速度也很快。①前期對基因組的片段化以及兩端連接adaptorA,B與其他二代測序技術類似，②不同的是它沒有用beads，核心反應容器是可以吸附流動DNA片段的測序流動槽（flowcell），每個flowcell上有8個道（lane），lane上面有與adaptorA,B相互配對的序列，所以可以固定DNA。③橋式PCR擴增與變性。先因為adaptorA,B序列而結合，形成拱橋性狀，開始擴增，完成後雙鏈和兩端會再變性分開，新產生的單鏈作為模板再開始橋式反應。最後的結果是會產生一簇正反向的目的片段（詳見下圖）。④測序，檢測熒光信號，整合結果。
第三代測序
PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies納米孔單分子測序技術被稱為第三代測序技術。其特點是不需要進行擴增，就是說小分子beads/橋式PCR的步驟是不需要的，而且產生的reads（讀長）較長（>20kb）。
PacBio 公司的SMRT (Rhoads and Au,2015)
這個方法有點在上面提了，且速度快，由於是實時檢測，所以還可以檢測鹼基的表觀修飾情況，如甲基化。但是缺點是錯誤率太高，以缺失序列和錯位居多。SMRT晶元為測序載體（如同flowcell），不同鹼基用不同熒游標記，在合成配對時檢測熒光信號。
實現實時長序列測序的關鍵第一是採用的DNA聚合酶的活性保持，第二是區分配對的反應信號與周圍游離鹼基的強大背景熒光，採用零模波導孔原理，在反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多圓形納米小孔達到降噪檢測的目的。
Oxford Nanopore 的MinION (Mikheyev and Tin,2014)
是基於電信號的測序。它的特點是儀器真的非常小，reads更加長（幾十甚至上百kb），而且DNA在測序中不被破壞，但是錯誤率同樣很高。它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代測序方法那樣需要事先對基因組進行bisulfite處理，這是因為存在表觀修飾的鹼基激發的電流強度是不同的。這對於在基因組水平直接研究表觀遺傳等相關現象有極大的幫助。
技術核心是特殊的納米孔，孔內共價結合分子接頭。當DNA分子通過納米孔時，它們使電荷發生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種鹼基所影響的電流變化幅度是不同的），最後高靈敏度的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的鹼基。
參考文獻
Albrecht, G., Brenner, S., Dubridge, R.B., Lloyd, D.H., and Pallas, M.C. (2000) Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors. In: Google Patents.
Hedges, D.J., Guettouche, T., Yang, S., Bademci, G., Diaz, A., Andersen, A. et al. (2011) Comparison of three targeted enrichment strategies on the SOLiD sequencing platform. PloS one 6 .
Jarvie, T. (2005) Next generation sequencing technologies. Drug Discovery Today: Technologies 2 : 255-260.
Maxam, A.M., and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 74 : 560-564.
Merriman, B., D Team, I.T., and Rothberg, J.M. (2012) Progress in ion torrent semiconctor chip based sequencing. Electrophoresis 33 : 3397-3417.
Mikheyev, A.S., and Tin, M.M. (2014) A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer. Molecular ecology resources 14 : 1097-1102.
Quail, M.A., Kozarewa, I., Smith, F., Scally, A., Stephens, P.J., Durbin, R. et al. (2008) A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods 5 : 1005.
Rhoads, A., and Au, K.F. (2015) PacBio sequencing and its applications. Genomics, proteomics & bioinformatics 13 : 278-289.
Ronaghi, M. (2001) Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome research 11 : 3-11.
Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the national academy of sciences 74 : 5463-5467.
Sutton, G.G., White, O., Adams, M.D., and Kerlavage, A.R. (1995) TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects. Genome Science and Technology 1 : 9-19.
③ 焦磷酸測序一個樣品多少錢
焦塵碧磷酸測序現在都是自動化了，價橋渣格每個地區可能會不一樣，廣州這邊的市場大概是25元一個反應（一個反應大敏兄悄概有800bp數據量）
④ 焦磷酸測序的介紹
焦磷酸測序技術(pyrosequencing)是一種新型的酶聯級聯測序技術，焦磷彎銀返酸測序搏亂法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序埋飢法相媲美，而速度卻大大的提高。焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力，為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性(single nucle—otidepotymorphisms，SNPs)研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。
⑤ [甲基化問題錦集]
今天和大家聊聊甲基化。
問：什麼是表觀遺傳修飾？
答：基因組表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化修飾與核小體中組蛋白的修飾等，使得被修飾DNA的空間結構發生改變或使染色體結構發生改變，導致基因的沉默或過度表達。這兩種修飾都是在不改變DNA鹼基種類與數量的前提下使生物體表型呈現出多樣化。
問：什麼是DNA甲基化？
答：DNA甲基化是指在DNA 甲基化轉移酶的作用下，將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5』-甲基胞嘧啶的過程。
問：DNA甲基化修飾有什麼作用？
答：DNA甲基化是最早發現的一種表觀遺傳修飾，可能存在於所有高等生物中， 它並乎游不改變基因的鹼基序列， 而是通過改變基因的表達影響細胞的功能，與基因沉默、X染色體失活、基因組印記、RNA i以及腫瘤等生物事件密切相關，它們的共同作用機制是調節基因的表達。
問：不同生物，DNA甲基化類型是一樣的嗎？
答：當然不一樣啦。原核生物中甲基化多發生在CCA/TGG和GATC序列，而真核生物中DNA甲基化一般只發生在CpG位點上，哺乳動物DNA甲基化只發生在CpG島的胞嘧啶，植物甲基化發生在CpG和CpNpG。
問：什麼是CpG島？
答：CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段CpG序列密度很高，可達到均值5倍以上即所謂的CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子（promotor）和第一外顯子區域，約有60%以上基因的啟動子含有CpG島。CpG島的GC含量大於50%，經梁頌常出現在真核生物的編碼基因的調控區。
問：CpG島為什麼要有個"p"，而不叫CG島？p有什麼特殊含意？
答：CpG是胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤的縮寫，p代表磷酸。
問：如何預測CpG島？
答：由於CpG 島區域較小，研究起來更為方便，因此，眾多的研究熱點集中在CpG 島甲基化狀態的研究上。而研究CpG島甲基化的前提條件是確認最合適的CpG 島區域。
目前有一些網站可以進行CpG島的預測，我推薦幾個比較好用的：
CpG Island（ http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx ） http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=TPM1+HOMO
http://www.urogene.org/methprimer/
CpGfinder( http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoter )
CpG islands revealing( http://l25.itba.mi.cnr.it/cgi-bin/wwwcpg.pl )
CpGPlot/CpGReport/Isochore( http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html )
然後用實驗證實，可以用bisulfite sequencing來比較處理前後的不同，找到甲基化位點。
問：驗證特定甲基化位點，並進行甲基化程度分析有哪些方法？
答：採用對照組和實驗組樣本進行甲基化驗證。
(1) MSP方法：可進行特定位點甲基化驗證，適用於甲基化晶元後的結果，無法進行甲基化程度分析；
(2) BSP克隆測橡頃鄭序法：驗證某些相關基因的甲基化位點，並精確計算出甲基化程度百分比；
(3) HRM法：適用於大批量樣本甲基化驗證，並能計算出甲基化程度范圍。
(4) 焦磷酸測序：測序有效長度不超過60bp，精確定量每一個CpG位點。
(5) MassARRAY® 平台：用於單個基因啟動子區域的甲基化檢測；每個反應覆蓋長達500 bp的多個CpG位點； 精準定量每一個CpG位點。
問：剛剛開始研究甲基化，如何尋找甲基化位點？
答：甲基化的研究是近年來較為火熱的研究領域之一，您是不是也對它垂涎已久，卻苦於無從下手？其實甲基化的研究並沒那麼難，一句話，還是套路！
首先，甲基化位點的篩選，可以使用全基因組Bisulfite測序（WGBS）、簡化基因組甲基化測序（MethylRAD技術）或者甲基化晶元進行基因組整體水平甲基化檢測，每種方法各有利弊，要根據實際的研究方向選擇不同的方法。對於樣品間差異甲基化位點的篩選，可以採用WGBS和MethylRAD技術，其中MethylRAD技術可以應用於無參考基因組的物種，Illumina Methylation EPIC晶元只能用於人類的DNA甲基化水平檢測。當然也可以根據一些相關研究顯示某些基因存在表達量降低的現象，預測該基因是否存在CpG島；或者根據文獻尋找相關基因的甲基化位點。
其次，對選擇的特異位點進行甲基化驗證，並進行甲基化程度分析。
最後，根據對照組和實驗組樣本的檢測結果，分析甲基化位點與研究的相關性。
問：只知道基因名稱，如何做甲基化檢測？
答：只需要將物種及基因信息告知相應或測序公司，會為您提供全方位的檢測服務。
原文： 甲基化問題錦集
⑥ 定時定量焦磷酸測序儀測一個樣多長時間
15分鍾內平行分析1-24個樣本。。實時定量焦磷酸測序儀是一種用於基礎醫學領域的醫學科研儀器，於2015年12月7日啟用。技術指標SNP檢測，DNA甲基化檢測，等位基因檢測。可靠的定量分析等升胡備位基因和甲基吵毀化做汪狀態，15分鍾內平行分析1-24個樣本。
⑦ 焦磷酸測序技術為什麼能正確測定DNA的序列
Pyrosequencing是一項全新的DNA測序技術，可以快速、准確地測定一段較短的目標片段。其基本原理如下：
第1步：1個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然後加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。
第2步：向反應體系中加入1種dNTP,如果它剛好能和DNA模板的下一個鹼基配對，則會在DNA 聚合酶的作用下，添加到測序引物的3『末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸（PPi）。
第2步圖示(圖片來自互聯網)
第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP;在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過CCD光學系統即可獲沒廳得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的鹼基數成正比。
第3步圖示(圖片來自互聯網)
第4步：反猛鏈應體系中剩餘的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發生降解。
第4步圖示(圖片來自互聯網)
第5步：加入另一種dNTP,使第2-4步反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取准確的DNA序列信息。
第4步圖示(圖片來自互聯網)
Pyrosequecing技術操作簡單，結果准確可靠，可應用於SNP位點檢測、等位基因頻率枝察孫測定、細菌和病毒分型等領域。